Мусієнко М. М., Панюта О. О. Біотехнологія рослин. Навчальний посібник - страница 12



^ ХІД РОБОТИ

1. Банку з рослиною протерти спиртом і обпалити горло у полум’ї спиртівки.

2. Стерильним пінцетом витягти рослину тютюну із банки і помістити її у стерильну чашку Петрі.

3. Притримуючи рослину пінцетом, скальпелем обрізати листки.

Верхівку рослини тютюну з апікальною меристемою доцільно помістити у банку з середовищем для рослин МС.

4. Окремий листок перенести у стерильну чашку Петрі і нарізати на сегменти площею 0,5-1,0 см2.

5. Листкові експлантати помістити на середовище для стеблового органогенезу МКР-1.

6. Культивувати при 250С+10С і 16-годинному фотоперіоді.

7. Через 2-3 тижні починається формування стеблових бруньок.

8. Через 3-4 тижні відокремити окремі великі бруньки і преренести на середовище МС для отримання паростків. Умови культивування ті ж.


Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну

Мета роботи: отримати культуру коренів тютюну із листкових дисків.

^ Матеріали і обладнання: рослини тютюну, вирощені in vitro, баночки зі стерильним середовищем МС, чашки Петрі з середовищем МКР-2 (табл. 15 ), стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, спирт, спиртівка, парафілм, ламінар-бокс.


^ ХІД РОБОТИ

1. Банку з рослиною протерти спиртом і обпалити горло у полум’ї спиртівки.

2. Стерильним пінцетом витягти рослину тютюну із банки і помістити її у стерильну чашку Петрі.

3. Притримуючи рослину пінцетом, скальпелем обрізати листки.

Верхівку рослини тютюну з апікальною меристемою доцільно помістити у банку з середовищем для рослин МС.

4. Окремий листок перенести у стерильну чашку Петрі і нарізати на сегменти площею 0,5-1,0 см2.

5. Листкові експлантати помістити на середовище для ризогенезуМКР-2.

6. Культивувати при 250С+10С і 16-годинному фотоперіоді.

7. Через 2 тижні спостерігається поява коренів.


Робота 16. Прямий ембріогенез

Мета роботи: отримати соматичні ембріоїди шляхом прямого ембріогенезу і проростити з них рослини моркви.

^ Матеріали і обладнання: 70%-й розчин спирту, стаканчики із стерильною дистильованою водою, концентрований розчин “Білизни”, стаканчик для стерилізуючого розчину, мірний циліндр, насіння моркви, чашки Петрі з середовищем для рослин МС, колби Ерленмейера з рідким середовищем МКР-3 (табл. 15 ), чашки Петрі зі стерильним фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, марля, пінцети, скальпелі, спиртівка, спирт для стерилізації інструментів, парафілм, фольга, ламінар-бокс, шейкер.

^ ХІД РОБОТИ
Робота складається з кількох послідовних етапів.

Етап 1. Стерилізація і пророщування насіння моркви.

1. Простерилізувати насіння моркви (робота 4).

Умови стерилізації: витримати 2 хв у 70% етанолі, потім 15 хв – у розчині “Білизни” (1:3), тричі промити стерильною дистильованою водою (по 10 хв).

2. Стерильним пінцетом перенести насіння на безгормональне середовище МС у чашки Петрі.

3. Чашки закрити парафілмом і підписати.

4. Чашки з насінням культивувати у термостаті при 270-280С протягом двох тижнів.

Етап 2. Індукція ембріогенезу.

1. Стерильним пінцетом перенести проростки моркви у чашки Петрі.

2. Притримуючи проросток пінцетом, скальпелем порізати гіпокотиль на сегменти довжиною 0,5-1,0 см.

3. Сегменти гіпокотилів перенести у колби з рідким середовищем МКР-3.

4. Закрити колби кришками з фольги і підписати.

5. Колби з рослинним матеріалом культивувати у темряві при 270-280С на шейкері при 100 об/хв протягом трьох діб.

Етап 3. Утворення ембріоїдів.

1. Через 3 доби стерильним пінцетом дістати сегменти гіпокотилів із колби і відмити у двох порціях стерильної дистильованої води (по 10 хв).

2. Для підсушування стерильним пінцетом перенести рослинний матеріал у стерильну чашку Петрі з фільтрувальним папером.

3. Розкласти експлантати у чашки Петрі з агаровим середовищем МС.

4. Чашки закрити і підписати.

5. Чашки з рослинним матеріалом культивувати у термостаті при 270-280С. Через 3-4 тижні утворюються соматичні ембріоїди.


Етап 4. Пророщування ембріоїдів.

1. Через 3-4 тижні експлантати з ембріоїдами перенести у стерильну чашку Петрі.

2. Скальпелем відокремити соматичний ембріоїд і перенести у чашку Петрі з агаровим безгормональним середовищем МС.

3. Чашки з рослинним матеріалом культивувати при 280С і 16-годинному фотоперіоді.


Робота 17. Непрямий ембріогенез

Мета роботи: отримати соматичні ембріоїди шляхом непрямого ембріогенезу і проростити з них рослини моркви.

^ Матеріали і обладнання: рослини моркви, вирощені in vitro, чашки Петрі з середовищем МКР-4 (табл. 15), чашки Петрі з середовищем МКР-5 (табл. 15), баночки з середовищем МС, стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, спирт, спиртівка, парафілм, ламінар-бокс.


^ ХІД РОБОТИ

Отримання рослин шляхом непрямого ембріогенезу передбачає послідовну зміну відповідних стадій культивування:

1. Індукція проембріогенної калюсної маси.

2. Розвиток ембріоїдів.

3. Проростання ембріоїдів і формування рослин.

Тому робота складається з кількох етапів, які відповідають стадіям культивування.

Етап 1. Індукція проембріогенної калюсної маси.

1. Стерильним пінцетом витягти рослину із пробірки і помістити її у стерильну чашку Петрі.

2. Притримуючи рослину пінцетом, скальпелем відрізати листки моркви і розрізати черешки листків на сегменти довжиною близько 1 см.

3. Рослинні експлантати помістити у чашки Петрі з калюсогенним середовищем МКР-4.

4. Закрити чашки парафілмом і підписати.

5. Чашки з рослинним матеріалом культивувати у термостаті при температурі 270С протягом 1-2 місяців.


Етап 2. Розвиток ембріоїдів.

1. Експлантат з калюсом помістити у стерильну чашку Петрі.

2. Скальпелем відділити калюс від експлантата і поділити на рівні фрагменти.

3. Шматочки калюсу перенести на свіже живильне середовище МКР-5.

4. Чашки закрити і підписати.

5. Чашки з калюсом культивувати у термостаті при 270С.

6. Один раз на місяць необхідно пересаджувати калюсну тканину на свіже живильне середовище.

При вирощуванні в цих умовах через 4-6 тижнів починається формування ембріоїдів.


Етап 3. Пророщування ембріоїдів і формування рослин.

1. Через 8-10 тижнів калюс з ембріоїдами перенести у стерильну чашку Петрі.

2. Скальпелем відокремити зрілий ембріоїд від калюсної маси і помістити на агарове безгормональне середовище МС.

У баночку поміщають по 3 ембріоїди.

3. Банки з рослинним матеріалом культивувати при 280С і 16-годинниму фотоперіоді.

4. За цих умов вирощування через 6-8 тижнів із соматичних ембріоїдів виростуть рослини


культура ізольованих протопластів вищих рослин


Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин

^ Мета роботи: оволодіти методикою виділення і культивування протопластів із мезофілу листка; отримати ізольовані протопласти із мезофілу листка рослин картоплі.

^ Матеріали і обладнання: асептичні рослини картоплі, ферментні препарати - Cellulysin, Macerase, Driselase, глюкоза, сахароза, ксилоза, манітол, CaCl2·2H2O, NaCl, KCl, NH4NO3, KNO3, MgSO4·7H2O, KH2PO4, NH4Cl, FeSO4·7H2O, Na2ЕДТА·2H2O, H3BO3, MnCl2·4H2O, ZnSO4·7H2O, CuSO4·5H2O, CoSO4·7H2O, KI, Na2MoO4·2H2O, мезоінозит, гліцин, нікотинова кислота, фолієва кислота, біотин, аденін сульфат, гідролізат казеїну, тіамін, піридоксин, ІОК, НОК, 2,4-Д, БАП, зеатин, 1N KOH, агар, стакани на 200 мл, мірні циліндри, мірні піпетки, пастерівські піпетки, чашки Петрі діаметром 60 мм і 100 мм, колби Ерленмейера на 250 мл і 50 мл, колбочки зі скляними лійками і нейлоновими фільтрами (діаметр пор 50-100 мкм), центрифужні пробірки з гумовими пробками, шприц з насадкою з фільтрами “Millipore” з діаметром пор 0,22 мкм або 0,45 мкм, стерильний фільтр Зейтца, ваги, шпателі, пінцети, скальпелі, лезо у держаку, магнітний змішувач, рН-метр, настільна центрифуга, інвертований мікроскоп, плитка, автоклав, ламінар-бокс, спиртівка, вата, фольга, спирт, парафілм.


^ ХІД РОБОТИ

Робота складається з кількох етапів.

Етап 1. Підготовка до досліду.

1. Приготувати середовище виділення протопластів SI: 0,5 М розчин сахарози з 5 мМ CaCl2.

2. Приготувати середовище W-5 для відмивання протопластів (табл. 16).

3.Приготувати середовище W-S-S для культивування мезофільних протопластів картоплі ( табл. 16).

Для культивування мезофільних протопластів тютюну використовують середовище К-3 ( табл. 16 ).

4. Приготувати середовища ST-1, ST-2 і ST-3 ( табл. 16).

Для регенерації рослин тютюну використовують середовище RMOP (табл. 16).

5. Простерилізувати середовища.

6. Простерилізувати посуд для досліду:

Таблиця 16

Середовища для виділення і культивування протопластів картоплі і тютюну та регенерації з них рослин (мг/л)

Компоненти

W-5

K-3

W-S-S

ST-1

ST-2

ST-3

RMOP

NaCl

9000



















NH4NO3




250

1280







1650

1650

KNO3




2500




1900

1900

1900

1900

CaCl22H2O

18400

900

600

440

440

440

440

MgSO47H2O




250

300

370

370

370

370

KH2PO4







170

170

170

170

170

KCl

800




300













Na2PO4H2O




150
















(NH4)2SO4




134
















NH4Cl










267

267







Fe-хелат




250

250

250

250

250

250

H3BO3




3

6

6

6

6

6

ZnSO47H2O




2

10

10

10

8.6

10

CuSO45H2O




0.025

0.025

0.025

0.025

0.025

0.025

CoCl26H2O




0.025

0.025

0.025

0.025

0.025

0.025

KI




0.75

0.83

0.83

0.83

0.83

0.83

Na2MoO42H2O




0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

MnSO4H2O




10

10













MnSO44H2O










22.3

22.3

22.3

22.3

Мезоінозит




100

100

100

100

100

100

Гліцин










2

2

2




PP




1

1

5

5

5




Фолієва кислота










0.5

0.5

0.5




Біотин










0.05

0.05

0.05




Аденін сульфат










40

80

40




Гідролізат казеїну







500

300

100







В1




10

10

0.5

0.5

1

10

В6




1

1

0.5

0.5

0.5

1

ІОК













0.1




0.1

НОК




0.2

2

1










2,4-Д




1

0.2













БАП




0.2

0.5

0.5







1

Зеатин













0.5







Сахароза




10000




2500

2500

25000

10000

Глюкоза

1000




72000













Ксилоза







250













Манітол




72800




54600

36400







Агар










1%

1%

0.7%

0.7%

pH

5,7

 - середовище стерилізувати фільтруванням


- у сушильній шафі: чашки Петрі діаметром 60 мм і 100 мм, колби Ерленмейера на 50 мл закриті фольгою, пастерівські піпетки,

- у автоклаві: колбочки зі скляними лійками з нейлоновими фільтрами, центрифужні пробірки з гумовими пробками, шприц з насадкою для фільтрування, фільтр Зейтца.


Етап 2. Приготування ферментних розчинів

і ферментація тканин.

1. Приготувати ферментну суміш, яка містить 1% Cellulysin, 0,5% Macerase і 0,1% Driselase в середовищі виділення.

^ Для ферментації мезофілу тютюну використовують суміш, яка містить 0,5% Cellulase, 0,5% Macerase і 0,2% Driselase.

Калюсну тканину картоплі і тютюну ферментують у суміші, яка містить 1-2% Cellulase, 0,5-1% Macerase, 0,5-1% Driselase. Для ферментації варто брати свіжий і м’який калюс, який розсипається у ферментній суміші.

2. Відцентрифугувати суміш 10-15 хв при 2 тис. об/хв для осадження нерозчинних частинок.

3. Довести 1N КОН рН ферментної суміші до 5,6.

4. У боксі за допомогою шприца з насадкою з фільтром “Millipore” профільтрувати суміш у стерильну колбу Ерленмейера.

5. Розлити стерильний ферментний розчин по 7-10 мл в колби Ерленмейера на 50 мл.

Ферментні розчини краще готувати безпосередньо перед дослідом або за добу до досліду.

6. У боксі дістати із пробірки 4-тижневі рослини картоплі і помістити їх у стерильні чашки Петрі.

7. Притримуючи рослини пінцетом, скальпелем обрізати листки.

8. Акуратно притримуючи листки пінцетом, щоб не пошкодити мезофіл, лезом , закріпленим у держаку, нарізати їх тонкими ( до 1 мм завширшки) смужками.

9. Листкові смужки помістити на поверхню ферментної суміші у колби Ерленмейера, щоб тканина покривала всю поверхню суміші (  1 г тканини на 10 мл ферментної суміші).

10. Колби з рослинним матеріалом помістити у термостат на 16 год при температурі 260С.

Оптимальну температуру і час інкубації необхідно підбирати для кожного конкретного випадку.


Етап 3. Виділення та очищення ізольованих протопластів.

1. Після інкубації додати у колби з рослинним матеріалом такий же об’єм середовища виділення.

2. Тотальний препарат протопластів профільтрувати через нейлонову сітку, щоб позбутися немацерованих шматочків тканини і елементів провідної системи.

3. Фільтрат стерильною піпеткою перенести у центрифужні пробірки (  4/5 об’єму пробірки).

4. На фільтрат по стінці пробірки акуратно за допомогою піпетки нашарувати середовище W-5 (  1/5 об’єму). Закрити пробірки і відцентрифугувати при 100 g 3 хв.

5. Поки йде центрифугування, у чисті центрифужні пробірки налити середовище W-5 (  4/5 об’єму ).

6. З центрифугату акуратно відібрати стерильною піпеткою верхній шар, в якому містяться протопласти, які флотували на межі середовищ, і перенести у центрифужні пробірки з середовищем W-5 і відцентрифугувати при 80 g 3 хв.

7. Піпеткою акуратно відібрати надосадову рідину.

8. Відмивання протопластів проводимо ще раз.


Етап 4. Культивування ізольованих протопластів

і регенерація рослин.

1. У стерильні чашки Петрі ( діаметр 60 мм ) налити 2-3 мл середовища для культивування ізольованих протопластів W-S-S.

2. 2-3 краплі густої суспензії протопластів у середовищі W-5 піпеткою перенести в чашки Петрі з середовищем W-S-S.

3. Культивувати протопласти на розсіяному світлі при температурі 250+10С. Щодоби спостерігати за розвитком протопластів під інвертованим мікроскопом.

4. Після утворення клітинних колоній ( через 8-10 діб ) до суспензії клітин додати свіже живильне середовище W-S-S і в міру розведення суспензії частину колоній з середовищем перенести в нові чашки Петрі.

5. Колонії, які досягли розмірів 0,5-1 мм перенести на агарове середовище ST-1 для формування мікрокалюсів. Культивувати на світлі 3-4 клк при 16-годинному фотоперіоді.

6. Через 10-15 днів яскраво-зелені колонії діаметром 1-3 мм перенести на середовище ST-2 для органогенезу і культивувати при 250С, 16-годинному фотоперіоді і освітленні 3-4 клк 25-30 днів.Часто для регенерації рослин необхідно повторно пересаджувати колонії на свіже середовище ST-2.

7. Сформовані пагони висотою 3-10 мм відділити від калюсу і перенести на безгормональне середовище ST-3 для вкорінення.

Оформлення роботи: замалювати ізольовані протопласти і клітинні колонії, описати калюси і рослини-регенеранти.

^ СЛОВНИК ТЕРМІНІВ


3187540309513011.html
3187670636757227.html
3187731664750142.html
3187895893737941.html
3187964658698664.html